روش رایجی که بیشتر توسط محققین جهت تشخیص سلول‌های طبیعی و نئوپلاستیک بر روی لام فیکس شده، صورت می‌گیرد، بر اساس ارزیابی‌های سیتولوژیکی و شکل ظاهری (مرفولوژی) آنها مبتنی است. متخصصین آسیب‌شناسی علی رغم تهیه رنگ‌های متنوع جهت رنگ‌آمیزی سلول‌های مختلف یک بافت، به سهولت و به سرعت قادر به شمارش انواع سلول‌های موجود در مقطع بافت مورد مطالعه نیستند و همچنین نمی‌توانند سلول‌هایی را که دارای منشأ اجدادی گوناگون و یا در مراحل مختلف تمایز هستند، تشخیص دهند. در طی سال‌های دهه ۶۰ میلادی تلاش جمعی از دانشمندان در زمینه‌های مختلف منجر به ابداع تکنیک فلوسایتومتری گردید، که این تکنیک در زمینه بر طرف نمودن مشکلات فوق از توانایی های خاصی برخوردار است.

سیتومتری ( Cytometry ) یا یاخته سنجی به معنی تفکیک اجزاء سلولی متعدد در یک نمونه است. دستگاه فلوسایتومتری اجزاء متعدد سلولی را تعیین کرده و هم زمان مورد شمارش قرار می دهد. خصلت هایی که توسط فلوسایتومتری قابل اندازه گیری هستند، شامل اندازه سلول، پیچیدگی سیتوپلاسمی، محتوی DNA یا RNA سلول و طیف گسترده ای از پروتئین های داخل سلولی و یا متصل به غشا می باشد.
در روش فلوسایتومتری سلول های رنگ آمیزی شده ( چه به وسیله منوکلونال آنتی بادی متصل به فلورسنت و چه فلوروکروم های متصل شونده به اجزاء سلولی ) در یک جریان سیال قرار گرفته و به صورت تک تک از مقابل پرتوی نوری ( لیزر ) عبور می کنند و متعاقب آن، نور پراکنده شده و نور فلورسانس جانبی توسط آشکار سازها جمع آوری می شوند. این آشکارسازها، سیگنال های نوری را به سیگنال های الکتریکی متناسب با نور جمع آوری شده تبدیل می کنند. پراکنش نور در زاویه های مختلف می تواند سلول ها را بر اساس تفاوت در اندازه و پیچیدگی درونی از هم متمایز کند، در حالی که ساطع شدن نور فلورسانس از آنتی بادی نشاندار شده با فلورسنت می تواند سلول ها را بر اساس تفاوت در آنتی ژن های سطحی و سیتوپلاسمی از هم تفکیک نماید. بدین ترتیب سلول ها بر اساس خصوصیاتی نظیر حجم، گرانولاسیون و میزان رنگ پذیری از هم افتراق داده می شوند.

در طول سالیان گذشته، ایمونوفنوتایپینگ توسط فلوسایتومتری، کمک بسیاری در تشخیص، طبقه بندی و پی گیری بعد از درمان سرطان های خون کرده است. امروزه اساس طبقه بندی بدخیمی های خون بر پایه خصوصیات طبیعی سلول های رده های مختلف در مراحل بلوغ می باشد. ایمونوفنوتایپینگ توسط فلوسایتومتری روشی سریع و آسان است. این روش با خصوصیت منحصر به فردی که دارد، سلول های مختلف را بر اساس آنالیز چند پارامتری تشخیص می دهد.
فلوسایتومتری نقش مهمی در زمینه‌های مختلف آسیب شناسی، هماتولوژی، ایمنی شناسی، بیماری‌های عفونی، بررسی پیوند اعضاء، نئوپلازیا و ژنتیک دارد و از طرفی بررسی وقایع چرخه سلولی و نقایص موجود در DNA جهت تشخیص انواع لوکمی‌ها و لنفوم‌ها بوسیله فلوسیتومتری امکان‌پذیر است. همچنین این روش در تشخیص بیماری‌ها، تعیین پیش آگهی و هم برای ارزیابی درمان بدخیمی‌ها کاربرد دارد. فلوسایتومترهای کلینیکی معمولاً برای استفاده‌آزمایشگاه‌های کلینیکی تنظیم شده است، اما بعضی از آنها ظرفیت جداسازی( Sorting ) انتخابی سلول‌ها را دارا می‌باشند که در کارهای تحقیقاتی مورد استفاده هستند. پیشرفت‌های هم زمان در وسایل و تجهیزات، تولید آنتی‌بادی‌های منوکلونال، رنگ‌های فلورسانس، کامپیوتر و نرم‌افزار، دریچه جدیدی جهت استفاده از تکنیک فلوسایتومتری، در آزمایشگاه‌های کلینیکی گشوده است.
در فلوسایتومتری مدرن، مجموعه ای از فن آوری های گوناگون برای سنجش سلول ها و بررسی ساختمان و محتوی درونی آن ها بکار گرفته شده است. در این روش حتی ذرات کوچکتر از ۱/۰ میکرومتری قابل تشخیص بوده و آستانه رنگ سنجی آن حدود ۱۰۰۰ مولکول رنگ یا ۱۸-۱۰*۱ گرم رنگ به ازای هر سلول است. بدین مفهوم که اگر یک گرم رنگ در حجمی به ابعاد m300 * Km 3000 * Km3000 حل شود، دستگاه قادر به تشخیص آن می باشد.

کاربردهای فلوسایتومتری
به طور کلی کاربرد پزشکی فلوسایتومتری را می توان در چهار مورد خلاصه کرد:
۱- تشخیص و طبقه بندی سرطان های خون ( توانایی تشخیص دقیق جمعیت های سلولی غیر طبیعی همراه با تعیین رده و میزان بلوغ سلول ها )
۲- سنجش فاکتورهای بیولوژیکی و حضور بعضی مولکول های اختصاصی که در تعیین پیش آگهی بیماری نقش دارند. ۳- شناسایی آنتی ژن هایی که به عنوان هدف های درمانی استفاده می شود ( استفاده از آنتی بادی بر علیه آنتی ژن های خاص که سلول بدخیم آن را بیان می کند )
۴- شناسایی سلول های باقی مانده بدخیم در طول درمان که در تعیین پاسخ به درمان و احتمال عود بیماری بسیار مهم هستند.

مزایای سیستم فلوسایتومتری بر سایر روش‌های اندازه‌گیری فلورورسانس

۱- عینی بودن Objective
۲- حساسیت بالا (دستگاه می‌تواند تا بیش از هزار مولکول فلوئوروکروم را در سلول مشخص کند)
۳- سرعت عمل زیاد که بررسی تعداد زیادی سلول را ممکن می‌سازد ( ۱۰۵*۱سلول در هر دقیقه )
۴- توانایی تشخیص سلول‌های نادر با مشخصات اختصاصی در یک جمعیت هتروژن و ناهمگن
۵- توانایی مطالعه سلول‌های زنده فیکس نشده
۶- توانایی اندازه‌گیری معیارهای همزمان چندین پارامتر و تطابق چند حساسیت هر سلول معلق در مایع
اصول
تکنولوژی فلوسایتومتری بر اساس خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سلول‌ها یا دیگر ذرات می‌باشد، هنگامی که این سلول‌ها یا ذرات از مقابل یک سیستم آشکارسازی نوری Photo Detector عبور می‌کنند، ارزیابی می‌گردند. از آن جایی که هر سلول وقتی از جلو سیستم گذر می‌نماید، به تنهایی اندازه‌گیری و آنالیز می‌شود و همچنین به سبب این که اندازه‌گیری‌های متعدد و مختلف در زمان واحد انجام می‌شود، بنابراین پارامترهای مختلف چند هزار سلول در طول مدت زمانی بسیار کوتاهی محاسبه می‌گردد. به‌طور کلی اینکه، دستگاه فلوسایتومتری به نحوی طراحی شده است که قادر است تعداد زیادی سلول و ذرات بیولوژیکی مانند هسته‌های جدا شده سلولی، کروموزوم‌ها و میکروارگانیسم‌ها را در محیط مایع با استفاده از اشعه لیزر، آنالیز نموده و خواص فیزیکی آنها مانند اندازه نسبی و میزان گرانولیتی سیتوپلاسم را مشخص نماید. باید دانست که فلوسایتومتری قادر است تعداد ۱ سلول سرطانی در میان ۱۰۰۰۰ تا ۱۰۰۰۰۰ سلول عادی موجود در نمونه مغز استخوان را شناسایی کند.
در اثر تابش اشعه لیزر به سلول‌ها و برحسب اندازه و ساختمان داخلی آنها، سیگنال‌های نوری حاصل می‌شود که بوسیله تقویت‌کننده‌های نوری PMT = Photo Multiplier Tube دستگاه به سیگنال الکتریکی تبدیل می‌گردد و پس از آنالیز بوسیله کامپیوتر به شکل نمودار نمایش داده می‌شود. چنانچه سلول‌ها به وسیله رنگ‌های اختصاصی DNA و RNA، پروتئین، شاخص‌های سطح سلول‌ها و اجزای درون سلولی رنگ‌آمیزی شده باشند، در اثر تابش اشعه لیزر، فلوروکروم متصل به آنها تحریک شده و در برگشت به حالت پایدار اولیه، سیگنال‌های فلوئورسنت خاص با طول موج جذبی مخصوص خود ایجاد می‌نماید. این سیگنال فوتون نوری، دارای طول موج بالایی بوده و انرژی تابشی دارد که مختص رنگ‌ آن است. سیگنال‌های فوق نیز به سیگنال‌های الکتریکی تبدیل گردیده و در نتیجه کلیه مشخصات سلولی، اعم از گرانولیتی، ساختمان درون سیتوپلاسم و شاخص‌های مورد نظر سطحی سلول به طور همزمان بصورت نمودار گزارش می‌شوند.

آماده سازی نمونه
برای انجام هر نوع فلوسایتومتری ابتدا باید سلول‌ها را آماده کرد، به طوری که سلول‌ها به صورت تکی درآمده و در محیط مناسبی معلق شده باشند. بعضا یک مرحله تخلیص برای بالا بردن غلظت سلول‌های مورد نظر در نمونه ضرورت پیدا می‌کند. روش‌های مختلفی برای تهیه، تخلیص وآماده سازی سلول وجود دارند و روش انتخاب شده به نوع سلول مورد ارزیابی بستگی دارد. پس از تهیه سوسپانسیون مناسب، سلول‌ها باید با مواد فلورسانس رنگ شوند و یا با آنتی‌بادی‌های کونژوگه با فلوروکروم نشاندار شوند. روش نشاندارکردن تحت تاثیر فاکتورهای زیادی مانند میزان اختصاصی بودن آنتی‌بادی و غلظت آنتی‌ژن در سطح یا داخل سلول، مناسب بودن غلظت آنتی بادی مورد استفاده و بکار بردن کنترل‌های مثبت و منفی مناسب در آنالیز سلول‌ها قرار می‌گیرد.
تمرکز هیدرودینامیک Hydrodinamic Focousing
خصوصیت اصلی یک سیستم فلوسایتومتری این است که اندازه گیری ها بر روی نمونه های سلولی که در دستگاه جریان می یابند، انجام می شود. اگر از یک لوله جهت انتقال نمونه استفاده شود، سلول ها نمی توانند به طور مکرر به نقطه اندازه گیری ( محل برخورد لیزر به سلول ) بروند. اگر از لوله های باریک جهت اطمینان از انتقال تکرار پذیر سلول ها استفاده شود، احتمال دارد با عبور سلول های بزرگتر مسیر بسته شود. برای حل این مشکل از روش ” تمرکز هیدرودینامیک Hydrodinamic Focousing ” کمک گرفته می شود. در این روش جریان آرامی از سلول ها را به درون جریان حامل سریع (Sheath fluid ) وارد می کنند. مایع حامل، سلول ها را در مرکز لوله متمرکز می کند، بنابراین سلول ها به طور منظم و در یک مسیر مجازی به نقطه اندازه گیری منتقل می شوند.

هدف از آماده‌سازی نمونه، تهیه یک سوسپانسیون از پارتیکل‌های منفرد است که به روش خاصی رنگ‌آمیزی شده‌اند تا در سیستم، بدون ایجاد اختلال در جریان یکنواخت مایع (سیال) و یا انسداد لوله و منافذ دستگاه عبور کنند. در سیستم فلوسایتومتری، سلول‌های معلق در مایع ایزوتونیک از طریق سیستم حسی با فشار هوا از ظرف حاوی نمونه به لوله مخصوصی منتقل شده و به یک محفظه خاصی به نام «حفره جریان» Flow chamber وارد می‌شوند، مایع پوششی Sheath fluid در حفره نمونه، یک اثر تمرکز هیدرو دینامیکی ایجاد کرده و نمونه را به داخل جریان می‌کشاند که زیادتر بودن سرعت جریان مایع پوششی نسبت به مایع حاوی نمونه، سبب هدایت سلول‌ها به صورت منفرد (تک‌تک) جهت عبور از سوراخ انتهایی می‌شود تا در نقطه خاصی در مقابل اشعه لیزر قرار بگیرد. سلول از لوله شیشه ای با سرعتی حدود ۵ تا ۵۰ متر در ثانیه از میان منفذی باریک و از مقابل پرتوی یک یا چند منبع نوری که غالبا لیزر است، عبور می‌کنند. بدین ترتیب امکان جمع‌آوری اطلاعات مربوط به ۵۰۰۰ تا ۵۰۰۰۰ سلول در هر ثانیه فراهم می‌شود.

فلورسانس
فلوسایتومتری بر خصوصیات پراکنده سازی نور توسط سلول‌ها و نیز بر نشر فلورسانس از آنها استوار است. نشر فلورسانس می‌تواند بااستفاده مستقیم از مواد رنگ‌کننده فلورسنت حاصل می‌شود (در این روش که مستقل از آنتی بادی است، غالبا از فلوکروم های متصل شونده به DNA ، RNA و یا دیگر اجزای سلولی استفاده می شود) یا ترکیبی از رنگ فلورسنت با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال که تحت نام عمومی کونژوگه مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این حالت انتخاب محل اتصال به سلول، توسط جزء آنتی‌بادی موجود در کونژوگه صورت می‌گیرد و این آنتی‌بادی است که بهصورت کاملا اختصاصی، آنتی‌ژن هدف را بر روی سلول یا در داخل آن شناسایی کرده و به آن متصل می‌شود و جزء فلورسنت موجود در کونژوگه ابزاری برای ردیابی محل و میزان آنتی‌بادی‌های متصل شده به هدف می‌باشد.
سیستم نوری
سیستم نوری فلوسایتومتر متشکل از یک یا چند منبع نوری به همراه یک سری از عدسی ها، فیلترها و آشکار سازها است. عدسی ها و فیلترها جهت انتقال نور منبع به نقطه اندازه گیری و نیز برای انتقال نور پراکنده و فلورسانس از نقطه اندازه گیری به آشکارسازها به کار می روند.
الف) منبع نور:
انواع مختلفی از منابع نوری برای فلوسایتومتر وجود دارند. در فلوسایتومترهای مدرن، نور لیزر به عنوان منبع نوری بکار می‌رود، لیزر نسبت به جیوه یا لامپ‌های دیگر مزایایی دارد که از آن جمله می‌توان به تولید نور منوکروم (تک‌رنگ) و با اندازه نقطه‌ای بسیار کوچک آن اشاره کرد، این اندازه نقطه‌ای بسیار مهم است، زیرا هرچه نور در فضای کوچک‌تری محدود شود، میزان تهییج سلول به حد ماکزیمم نزدیکتر می‌شود، علاوه بر این باعث اطمینان از قرار گرفتن تنها یک سلول در برابر نور در هر لحظه می‌گردد. بیشترین لیزر مصرفی نیز، لیزر آرگون با طول موج ۴۸۸ نانومتر می‌باشد که با هوا سرد می‌شود، ارزانتر هم بوده و قابل دسترس‌تر است. لیزرهای دیودی نیز به دلیل پایداری و قیمت ارزان مورد استفاده قرار می گیرند و معمولا طول موج ۶۳۵ نانومتر آن مورد استفاده است.

ب) فیلترها:
سیستم نوری فلوسایتومتر، سیگنال‌های فلوئورسانس ساطع شده از سلول‌ها را به یک سیستم الکترونیکی هدایت می‌کند، این سیستم از یک سری فیلترهای مخصوص جذب نور و آینه‌های Dichoric یا دو رنگ نما تشکیل شده است. فیلترهای نوری، فقط طول موج خاصی را عبور داده و مانع عبور سایر طول موج ها می شوند. فیلترهای دو رنگ نما، آینه های انتخابی هستند که اجازه عبور طول موج های بلند را می دهند و طول موج های کوتاه را منعکس می کنند. فیلتر باند عبوری جهت عبور باند باریکی از طول موج بین ۶۲۰-۶۴۰ نانومتر طراحی شده است. فیلترهای جذب نور در زاویه ۹۰ o نسبت به مسیر تابش اشعه لیزر قرار گرفته‌اند و آینه‌های Dichoric نسبت به فیلترها در زاویه ۴۵O قرار دارند. علاوه بر این دتکتورهای خاصی به منظور دریافت سیگنال‌های حاصل از اندازه سلول و گرانولیتی در این سیستم وجود دارند که اصطلاحاً Fs sensor و SS sensor نامیده می‌شوند. به مجرد عبور یک سلول از مقابل اشعه لیزر، چندین پارامتر فیزیکی و فلوئورسانس آن، بطور همزمان اندازه‌گیری می شود.

انواع گوناگون فیلترهای نوری

ج) آشکارسازها:
با عبور ذرات یا سلول ها از مقابل پرتو لیزری، مولکول های فلورسانس سطح سلول، فوتون هایی با طول موج خاص در همه جهات تابش می کنند. سیستم اپتیکی بخشی از این فوتون ها را به آشکارساز ها ( Detector ) می رسانند. فوتو دیود ها ( PD ) و فوتومولتی تیوب ها ( PMT ) به خاطر حساسیت بالای آن ها به عنوان آشکار ساز استفاده می شوند. ابتدا فوتون های رسیده از نمونه توسط آشکارسازها به فوتوالکترون تبدیل شده و سپس جریان الکتریکی آن به ولتاژ تبدیل می شود. به دلیل اینکه سیستم الکترونیکی، ولتاژ را اندازه گیری و مقایسه می کنند، باید خروجی آشکار ساز به ولتاژ تبدیل گردد. تبدیل جریان به ولتاژ با عبور جریان یا شار الکتریکی از یک مقاومت انجام می گیرد. آن چه اتفاق می افتد بر اساس قانون اهم قابل پیش بینی است. ولتاژ تولید شده برابر حاصل ضرب جریان در مقاومت است و چون مقدار مقاومت ثابت است ولتاژ خروجی مستقیما با متناسب با جریان ورودی است. مدار الکترونیکی که این تبدیل را انجام می دهد،” تقویت کننده Trans-impedence ” نام دارد که می تواند در مدار بخش PMT جا سازی شود. این مدار جریان فوتو الکترون ها را به ولتاژ تبدیل کرده و تقویت خطی ولتاژ را فراهم می کند.

پراکنش
اگر چه سلول‌ها به خودی‌ خود دارای فلورسانس اندکی در برخی طول موج‌ها هستند اما بدون بکارگیری نور تهییج کننده (لیزر) هیچ سیگنالی تولید و به ردیاب‌های دستگاه ارسال نخواهد کرد. پس از برخورد نور لیزر به سلول ها، بازتاب نور لیزر در جهات مختلف پراکنده شده و توسط ردیاب هایی که در زوایای مختلف قرار دارند، برای کسب اطلاعات جمع آوری می شود.
پراکنش نوری در زاویه جلوئی ,FALS) Forward Angle light Scatter )
در صورتی که سلول به صورت یک کره همگن و یکنواخت باشد، در اثر تابش لیزر، نور تحت زاویه ۳۶۰o توسط سلول پراکنده و بوسیله آشکار ساز مستقیم Fs sensor که در زاویه ۲-۲۰ o نسبت به محور تابش لیزر قرار دارد، دریافت و اندازه‌گیری می‌شود، این نور اصطلاحاً FALS نامیده می شود و مقدار آن رابطه مستقیم با اندازه سلول دارد. به عبارت دیگر نوری که در جهت مستقیم پراکنده می شود (Forward ) متناسب با سایز سلول یا ذره است.

پراکنش نوری ۹۰o / تفرق جانبی ,SS ) ( Ninety-degree /side-light scatter

مقدار نوری که تحت زاویه ۹۰ o نسبت به محور تابش لیزر از سلول پراکنده می‌شود. اصطلاحاً نور SS نامیده می‌شود و مقدار آن بستگی به خصوصیات شکست نور توسط سلول، اجزای درونی، میزان گرانولیتی سیتوپلاسم، ساختمان هسته و سطح سلول (ناهمواری غشاء) دارد. برای مثال یک گلبول قرمز رسیده با سیتوپلاسم همگن، بدون هسته و اندامک‌های سیتوپلاسمی، نسبت به یک یاخته ائوزینوفیل که حاوی گرانول‌های سیتوپلاسمی زیاد و هسته مرکب از چند قطعه است، تفرق نوری ۹۰ o بسیار کمتری دارد. سیگنال پراکنش نوری ۹۰o ، توسط آشکار ساز قائمه دریافت می شود و به سیگنال دیجیتالی تبدیل می گردد.

از نظر میزان نور SS، لنفوسیت‌ها و گرانولوسیت‌ها به ترتیب از کم به زیاد قرار دارند. به این ترتیب موازین FALS و SS می‌تواند برای مشخص کردن تیپ هر کدام از سلول‌ها بکار رود و رابطه آن بدین شرح است:

گلبول‌های قرمز و نخاله‌های سلولی > لنفوسیت > منوسیت > گلبول های سفید چند هسته ای

انتشار فلوئورسانس
علاوه بر این اگر مولکول های فلورسنت و یا فلوروکروم ها به سلول ها متصل شده باشند، توسط نور تابیده تهییج شده و بازتابی حاصل می شود که سایر ردیاب ها و فیلترهای نوری آن را جذب می کنند. مولکول های فلورسنت می توانند متصل شده به آنتی بادی ها، رنگ های حساس به Ca++ و متصل شده به اجزای سلولی، مولکول های فلورسنتی که توسط سلول بروز داده می شوند و رنگ های متصل شونده به DNA باشند. نتیجه دقیق، بررسی چند پارامتری هر ذره یا سلول است و تعداد پارامترهای بررسی شده بستگی به تعداد مولکول های فلورسنتی دارد مورد استفاده قرار گرفته است.

آشکار ساز فلورسانس، امواج فلورسانس منتشره از برخورد نور لیزر به فلوروکروم های متصل به سلول را دریافت می کند. این آشکار ساز در زاویه ۹۰o نسبت به منبع نوری یعنی روبروی آشکار ساز قائمه قرار می گیرد. در صورت مطالعه هم زمان چند فلوروکروم که به اجزاء مختلف سلولی متصل شده اند، می توانیم از چندین آشکار ساز فلورسانس استفاده کنیم.

نمایی از روند کاری فلوسایتومتری

بر اساس پارامترهای تفرق نوری (FALS و SS) می‌توان gateهای الکترونیکی (محدوده‌ها) بدور دسته جات سلولی مورد نظر برای تجزیه با فلورسنت کشید، آنگاه فلوئورسانس سلول‌ها در نمونه می‌تواند بطور انتخابی تعیین شود و بصورت توزیع کثرت ترسیم گردد. کلیه اطلاعات توسط یک کامپیوتر که در یک سیستم گنجانیده شده است، جمع‌آوری، محاسبه و ذخیره می‌گردد.

غالباً حجم مورد نیاز از نمونه موردآزمایش نیز خیلی کم و حدود ۱۰۰ میکرولیتر می‌باشد. بررسی فلوسایتومتریک هرچه زودتر باید انجام شود (پس از نمونه‌گیری)، بهرحال نمونه‌ها را می‌شود برای ۲۴ ساعت در دمای اتاق (مخصوص خون کامل) و یا ۴oC (مخصوص سلول‌های منونوکلئر جداشده) نگهداری نمود و سپس ایمونوفنوتایپینگ انجام داد. در هنگامیکه نمونه‌ها برای بیشتر از ۲۴ ساعت نگهداری می‌شوند، اضافه کردن محیط کشت سلولی، مانند RPMI ضروری است.

فلوروکروم ها

برای انجام فلوسایتومتری لازم است که ابتدا سلول‌ها با فلوروکروم‌ها نشاندار شوند. از طرفی برای نشاندار کردناجزاء داخلی سلول باید اقدامات خاصی را انجام داد تا آنها در دسترس آنتی‌بادی یا ماده فلورسنت قرار گیرند. تعداد فلوروکروم‌های مورد استفاده برای فلوسایتومتری در طی سالیان متمادی مرتبا افزایش یافته است و این احتمال وجود دارد که در آینده، تعداد فلوروکروم‌های مورد استفاده برای آنالیز سلول‌ها بیش از این نیز افزایش یابدشناخت انواع فلوروکروم‌ها و آگاهی از مزیت‌ها و معایب هر کدام تنها راه استفادهبهینه از آنها برای دستیابی به مقاصد علمی تحقیقاتی است. امروزه پرمصرف‌ترین رنگ‌های فلوئورسان متصل به آنتی‌بادی‌ها در فلوسایتومتری بالینی، فلوئورسین ایزوتیوسیانات (FITC) و فیکواریترین (PE) می‌باشند. تمامی این رنگ‌های فلوئورسان در محدوده۴۸۸nm طیف‌های جذبی دارند. بنابراین، یک، تک طول موج تحریکی لیزری، می‌تواند تمامی این دو رنگ را تحریک کند.
بر اساس پارامترهای تفرق نوری (FALS و SS) می‌توان gateهای الکترونیکی (محدوده‌ها) بدور دسته جات سلولی مورد نظر برای تجزیه با فلورسنت کشید، آنگاه فلوئورسانس سلول‌ها در نمونه می‌تواند بطور انتخابی تعیین شود و بصورت توزیع کثرت ترسیم گردد. کلیه اطلاعات توسط یک کامپیوتر که در یک سیستم گنجانیده شده است، جمع‌آوری، محاسبه و ذخیره می‌گردد.

غالباً حجم مورد نیاز از نمونه موردآزمایش نیز خیلی کم و حدود ۱۰۰ میکرولیتر می‌باشد. بررسی فلوسایتومتریک هرچه زودتر باید انجام شود (پس از نمونه‌گیری)، بهرحال نمونه‌ها را می‌شود برای ۲۴ ساعت در دمای اتاق (مخصوص خون کامل) و یا ۴oC (مخصوص سلول‌های منونوکلئر جداشده) نگهداری نمود و سپس ایمونوفنوتایپینگ انجام داد. در هنگامی که نمونه‌ها برای بیشتر از ۲۴ ساعت نگهداری می‌شوند، اضافه کردن محیط کشت سلولی، مانند RPMI ضروری است.
فلوروکروم ها
برای انجام فلوسایتومتری لازم است که ابتدا سلول‌ها با فلوروکروم‌ها نشاندار شوند. از طرفی برای نشاندار کردن اجزاء داخلی سلول باید اقدامات خاصی را انجام داد تا آنها در دسترس آنتی‌بادی یا ماده فلورسنت قرار گیرند. تعداد فلوروکروم‌های مورد استفاده برای فلوسایتومتری در طی سالیان متمادی مرتبا افزایش یافته است و این احتمال وجود دارد که در آینده، تعداد فلوروکروم‌های مورد استفاده برای آنالیز سلول‌ها بیش از این نیز افزایش یابد شناخت انواع فلوروکروم‌ها و آگاهی از مزیت‌ها و معایب هر کدام تنها راه استفاده بهینه از آنها برای دستیابی به مقاصد علمی تحقیقاتی است. امروزه پرمصرف‌ترین رنگ‌های فلوئورسان متصل به آنتی‌بادی‌ها در فلوسایتومتری بالینی، فلوئورسین ایزوتیوسیانات (FITC) و فیکواریترین (PE) می‌باشند. تمامی این رنگ‌های فلوئورسان در محدوده۴۸۸nm طیف‌های جذبی دارند. بنابراین، یک، تک طول موج تحریکی لیزری، می‌تواند تمامی این دو رنگ را تحریک کند.

فلوسایتومترهای اولیه قادر بودند فقط یک یا دو رنگ فلورسانس را تجزیه و تحلیل کنند اما امروزه دستگاه‌هایی عرضه شده‌اند که قادرند چندین رنگ فلورسانس رابه طور هم‌زمان ردیابی و تجزیه و تحلیل کنند. پیشرفت‌های همزمان در وسایل، تولید آنتی‌بادی‌های منوکلونال، رنگ‌های فلوئورسانس، کامپیوتر و نرم‌افزار، دریچه جدیدی جهت استفاده از تکنیک فلوسایتومتری، در آزمایشگاه‌های کلینیکی گشوده است.

سیستم کامپیوتری

این سیستم، پالس های دیجیتال را آشکار سازها دریافت کرده و به آنالیز داده ها می پردازد. امروزه نرم افزارهای جدیدی برای آنالیز سریع تر داده ها در دسترس می باشند. همچنین کنترل قسمت های مختلف دستگاه فلوسایتومتری بر عهده این سیستم می باشد.

اهمیت فلوسایتومتری در بررسی فنوتیپ سلول‌ها

آنتی‌ژن‌های سلولی که اصطلاحاً به نام (CD) clusters of Differentiation نامیده می‌شود، صرفاً شاخص‌های شناسائی انواع مختلف سلولی نیستند، بلکه فعالیت‌های مهم سلولی را تنظیم می‌کنند و اکثراً از جنس پروتئین یا گلیکوپروتئین هستند، این مولکول‌ها به عنوان گیرنده‌های فاکتورهای اصلی رشد، سیتوکین‌ها و پروتئین‌های سرمی عمل می‌کنند و یا به عنوان آنزیم‌های غشائی فعالیت نموده و اتصال سلول‌ها را به سایر سلول‌ها و اجزاء ماتریکس خارج سلولی میسر می‌نمایند، این شاخص‌های شناسائی به وسیله متدهای فلوسایتومتری به راحتی قابل تشخیص و ارزیابی می‌باشند. بررسی شاخص‌ها جهت افتراق جمعیت‌های سلولی خاص نیز بکار می‌رود و می‌توان بدین طریق با توجه به این شاخص‌های آنتی‌ژنی، سلول‌ها را از یکدیگر تفکیک داد. همچنین امروزه با تکنیک فلوسایتومتری FACS Fluorescence activated cell sorter علاوه بر خصوصیات سلول‌ها، می‌توان سلول‌ها را از یکدیگر تفکیک نموده و در لوله‌های جمع‌کننده مخصوص هر نوع سلول جمع‌آوری نمود و بر روی آنها تحقیقات انجام داد.

سلول‌ها از اجزاء مختلفی مثل غشاء سیتوپلاسمی، غشاء هسته‌ای، هسته و سیتوپلاسم تشکیل می‌شود و تقریبا همه مولکول‌های موجود در قسمت‌های مختلف سلول را می‌توان با استفاده از فلوسایتومتری ردیابی و تعیین مقدار نمود. معمولاً مولکول‌های سطحی موجود در غشاء سیتوپلاسمی به راحتی در دسترس آنتی‌بادی قرار می‌گیرند ولی برای رسیدن آنتی‌بادی یا ماده فلورسانس به مولکول‌های درونی سلول روش‌های مطمئن و موثری لازم است. هر سلولی بر حسب نوع و تخصصی که به عهده دارد مولکول‌های مختص به خود را بیان می‌کند، بدین معنی که همه ژن‌ها در همه سلول‌ها بیان نمی‌شوند بلکه برحسب وظیفه‌ای که در طی تمایز بر عهده سلول گذاشته شده است و بر حسب محیطی که در آن قرار می‌گیرد هر سلولی خود انتخاب می‌کند که در پاسخ به شرایط محیطی کدام ژن را فعال سازد. بنابر این ردیابی پروتئین‌های سلولی حاصل از بیان ژن‌ها هم در سطح و هم در درون سلول می‌تواند وسیله‌ای بسیار مفید برای شناسایی سلول باشد. مولکول‌های سطحی سلول‌ها تحت نام عمومی CD که مخففCluster Differentiation  می‌باشد شناخته می‌شوند و برای ردیابی آن ها از آنتی‌بادی‌های منوکلونال کونژوگه با فلوروکروم استفاده می‌شود. مثلا مارکرهای سطحی سلول های NKعبارتند از  CD16 و  CD56  که آنتی‌بادی هایی با همین نام قادرند این مولکول‌ها را در سطح سلول شناسایی نمایند. اغلب لفظ آنتی‌بادی در گفتار یا نوشتار حذف می‌شود مثلاً کونژوگه  CD16 همان آنتی‌بادی شناسایی کننده   CD16 می‌باشد که متصل به فلوروکروم است، یا کونژوگه CD 34 اشاره به آنتی‌بادی شناسایی کننده CD 34 دارد که با فلوروکروم مناسبی کونژوگه شده است، مارکر اختصاصی سلول‌های ریشه‌ای تمایز نیافته مغز استخوان می‌باشد.

جداسازی سلولی
بیشترین مورد استفاده از فلوسایتومتری، ارزیابی آنتی‌ژن‌های سطحی بیان‌شده بر روی سلول‌ها می‌باشد. اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌های مختلف برای اندازه‌گیری خصوصیات عملکردی بوسیله فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گیرند. می‌توان تغییرات زمانی بیان گیرنده‌ها را تعیین کرد یا بر همکنش یک نوع سلول را با سلول دیگر اندازه‌گیری نمود. بعلاوه، امکان ارزیابی تغییرات در فعالیت آنزیم‌ها و پتانسیل غشایی وجود دارد. همچنین می‌توان آزمایشاتی برای نشان دادن فاگوسیتوز و آزادسازی مولکول‌های فعال زیستی انجام داد  روش جداسازی سلول‌ها با استفاده از خصوصیات فلورسانس آن ها توسط ایمونولوژیست‌هایی ابداع شد که تلاش می‌کردند جمعیت‌های خالص سلول‌ها را از نمونه‌های مختلط تهیه کرده و پس از تکثیر آنها در محیط کشت سلولی، نقش مجزای هر سلول را در سیستم ایمنی بررسی نمایند. جداسازهای جریانی وسایلی ضروری و پرطرفدار در علوم بیولوژیکی و علوم دیگر هستند. کارآیی اصلی این جداسازها، چنانچه از نامشان بر می‌آید، جدا کردن جمعیت‌های سلولی دلخواه از میان جمعیتی هتروژن از سلول‌ها برای مطالعه بیشتر می‌باشد. بطور کلی اگر سلول یا ذره‌ای دارای خصوصیات منحصر به فردی از نظر فیزیکی یا شیمیایی باشد با استفاده از آن خصوصیات می‌توان براحتی آن را شناسایی کرده و از دیگر سلول‌های همراه جدا کرد.

جدا سازی سلولی

با استفاده هم‌ زمان از دو روش آنالیز سلولی و جدا ساز سلولی Cell Sorter مکان مطالعه بیشتر و کشت سلول‌های کاملا شناخته شده از نظر فنوتایپی یا رفتاری فراهم می‌گردد. در حضور یون‌های کلسیم خصوصیات طیفی برخی از رنگ‌های فلورسنت تغییر می یابد. از این رنگ‌ها برای اندازه‌گیری تغییرات غلظت کلسیم اجزاء سلولی در هنگامی ‌که سلول‌ها بوسیله انواع محرک‌ها تحریک می‌شوند استفاده می‌شود.

کنترل کیفی
داشتن برنامه‌های کنترل کیفی برای روش‌ها و تجهیزات در هر نوع فلوسایتومتری ضروری بوده و یک نیاز اساسی محسوب می‌گردد. این برنامه‌ها برای اطمینان از کیفیت نتایج بدست آمده به کار برده می‌شوند. همچنین برنامه‌های کنترل کیفی بایستی مرتبا و در حد کفایت انجام شوند تا تشخیص نقاط اشکال به آسانی ممکن گردد. بدین منظور، برنامه کنترل کیفی در هر دو زمینه، کنترل کیفی داخلی و روش‌های ارزیابی کیفی خارجی، باید به اجرا گذاشته شوند.
در فلوسایتومتری طی دو مرحله جمع‌آوری اطلاعات و مرحله آنالیز اطلاعات امکان خطا وجود دارد که با به کارگیری روش صحیح تهیه نمونه سلولی و تنظیم دقیق دستگاه می‌توان از خطاهای مربوط به مرحله جمع‌آوری اطلاعات جلوگیری کرد اما توانایی اپراتور در طراحی صحیح آزمایش، تنها جنبه‌ای از کسب اطلاعات است که برای آن روش‌های کنترل خطا وجود ندارد. بدین معنی که انتخاب آنتی‌بادی مناسب و انتخاب فلوروکروم متناسب با غلظت و موقعیت آنتی‌ژن نیازمند تجربیات و اطلاعاتی است که باید توسط محقق کسب شوند.
روش فلوسایتومتری در سایه افزایش روز افزون تعداد آنتی‌بادی‌ها، تترامرها و رنگ‌های تولید شده برای استفاده در ارزیابی فعالیت سلول‌ها به عنوان یک ابزار مهم در مطالعه سلول‌های سیستم ایمنی در آمده است. فلوسایتومتری چند رنگی این امکان را فراهم آورده است که انواع سلول‌های موجود در نمونه خون یا سلول‌های کشت شده به تفکیک مورد ارزیابی قرار گیرند. سلول‌های تحت مطالعه با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی معرف زیر گروه‌های سلولی، شناسایی می‌شوند و خصوصیات رفتاری آنها نیز با استفاده ازآنتی‌بادی‌های اختصاصی (مثلاً ضد سایتوکین) و یا رنگ‌های ارزیابی کننده حیات سلولی تعیین می‌شوند.

واحد آموزش گروه صنعتی مهر ابرار
علی اصغر صفری فرد
کارشناس ارشد خون شناسی